谷胱甘肽(GSH)含量测定
一、实验目的
1.了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程;
2.学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
二、实验原理
谷胱甘肽是有谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)组成的天然
三肽,是一种含巯基(—SH)的化合物,广泛存在于动物组织、植物组织、微
生物和酵母中。它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂,如与自由基、重金
属等结合,从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质,排泄出体外。
谷胱甘肽能和2-硝基苯甲酸(DTNB)反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷
胱甘肽二硫化物(GSSG),2-硝银行汇率、外汇汇率
基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物,在波长412nm
处具有最大光吸收。因此,利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
三、实验材料
小麦幼嫩叶片
四、实验方法及步骤
1.制作标准曲线
取7只干净的试管编号,按如下表格加入各试剂,反应20分钟后在412nm
下用分光光度计测其吸光度,制作标准曲线;
试管号
GSH标准液
(10ugml)
补水到2ml
2 1.9
4
0.4
1
1.8
4
0.4
2
1.6
4
0.4
4
1.4
4
0.4
6
1.2
4
0.4
8
1
4
0.4
10
1
0
2
0.1
3
0.2
4
0.4
5
0.6
6
0.8
7
1
磷酸缓冲液(PH=7)
4
DTNB试剂
0.4
GSH浓度(ug2ml)
0
2.样品测定
a、称取小麦叶片0.2g,加入少量5%偏磷酸缓冲液研磨提取,并用5%偏磷
酸缓冲液定容至6ml,8000rpm离心10min,取上清液;
b、取上述上清液2ml显色,操作同标准曲线。
3.结果计算:GSH含量(ugGfw)=(Cx*Vt)(Fw*Vs)
注:Cx---
2ml样品中GSH含量(ug),即每管中GSH的含量
Vt---样品提取液总体积(ml);
Vs----显色时所取样的体积(ml);
FW---样品鲜重(g)。
五、实验结果
1.标准曲线
银行汇率、外汇汇率
0.8
0.7
0.6
y=0.067x - 0.0005
R
2
=0.9943
吸
光
度
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0246
GSH浓度ug2ml
81012
1. 样品测定结果
试管号
吸光度
GSH浓度(ug 2ml)
GSH含量(ugg)
GSH平均含量(ugg)
1
0.048
0.724
10.86
2
0.05
0.754
11.31
10.86
3
0.046
0.694
10.41
六、注意事项
1.使用移液管吸取试剂时,视线要垂直于移液管且与液面凹面水平,不能斜视,
以免量取试剂不准确。
2.在提取样品时,最好沉淀出去蛋白质,以防止蛋白质中所含巯基及相关酶对测
定结果的影响。
3.在研磨叶片时,为方便研磨,刚开始时加入少量的提取液。
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