BCA(皖能电力股吧BCA蛋白)

2021年4月27日发(作者：后一步改名,资产注入都被大家猜中了,那又如何航天机电)

实验原理
BCA(bicinchoninic acid)是一种稳定的水溶性复合物，在碱性条件下，二价铜离
子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子可以和BCA相互作用，两分子
的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的络合物，该复合物为水溶性，在562nm
处显示强吸光性，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系，
制作标准曲线，因此可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。

实验准备
1. BCA定量试剂盒：含A液和B液
A液：BCA碱性溶液（配方：1%BCA二钠盐，0.4%氢氧化钠，0.16%酒石酸
钠， 2%无水碳酸钠，0.95%碳酸氢钠，这些液体混合后再调PH至11.25） B
液：4%硫酸铜
2.牛蛋白血清（BSA）
3.待测的蛋白样品
实验步骤

1.配置BCA工作液：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA
工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）
2.配置不同浓度的标准蛋白液（BSA），1ugul，2.5 ugul，5 ugul，7.5 ugul，
10 ugul，待测蛋白样品在什么溶液中，就用该溶液来稀释标准蛋白液（如待银行汇率、外汇汇率
测
样品溶于强RIPA裂解液，则用强RIPA裂解液来稀释标准蛋白液）。
3.取空白组（0ugul BSA）各浓度的标准蛋白液5ul加入96孔板中，另取待测
的蛋白样品5ul，加入96孔板。

PS：上图加样的量仅作为参考，蛋白液和BCA工作液的比例符合即可。
4.向各孔的蛋白液中加入300ul的BCA工作液，混匀，37度放置30分钟，
（加样时应当动作轻柔，防止产生气泡影响读数）。PS：温度和放置时间可以
调整，可在60度放置30分钟or室温放置2小时。
5.静置结束后，冷却至室温，用酶标仪测定562nm出的吸光度，并制作标准曲
线。

6.根据待测样品的吸光度，比对标准曲线，计算蛋白的浓度。
注意事项
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度可随时间的延长不断加深，且显色反应会随温
度升高而加快，故如果浓度较低，适合较高温度孵育or延长孵育时间。
标准蛋白液的加量应当准确，如果加量不准确，会导致制作出来的标准曲线出
现偏差，影响待测样品的浓度计算，所以一方面需要用梯度稀释的方法来配置
标准蛋白液，另一方面应使用精确度高的移液枪。
A液和B液混合可能出现浑浊，此时应成分振荡混匀，最后可见透明溶液。
为加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但切勿过热。
当结果出现空白组本身就有较高的背景，可用Bradford法重新测定蛋白浓度。
优缺点
优点：
测定快速简便，45分钟内完成
准确灵敏,检测浓度为5-200 mgml
干扰物质少，BCA法不受大部分样品中的去垢剂等化学物质影响，可兼容样品
中高达5%的SDS，5%Triton X-100,5%的Tween 20
在一定浓度范围内，有良好的线性关系
检测不同蛋白质分子的变异系数银行汇率、外汇汇率
小于考马斯亮蓝法蛋白定量
缺点：
与荧|分红型基金光蛋白质定量等方法相比，属于化学呈色法的BCA法检测灵敏度尚不够
蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影响测定结果

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